• Saludos a todos y bienvenidos al taller de análisis de RNA-seq de una sola célula de Galaxy.
• Aquí lo guiaremos a través de algunos de los conceptos básicos y conceptos al tratar con datos de una sola celda.

• Comencemos con las diferencias entre Bulk RNA-seq y datos de secuencia de ARN de una sola célula.
• Con Bulk RNA-seq comparamos dos tejidos observando la expresión promedio de cada gen detectado en cada uno de los tejidos.
• Debido al número de moléculas de ARN que se están considerando, la profundidad de secuenciación y la fuerza del análisis es razonablemente alta.
• La expresión diferencial se mide luego como la expresión relativa de un gen dado entre un tejido y otro.

• Con el análisis de secuencia de ARN de una sola célula, la etapa se aleja de medir la expresión promedio de un tejido.
• Y hacia la medición de la expresión génica específica de células individuales dentro de esos tejidos.
• Aquí ya no comparamos tejido contra tejido, sino célula contra célula.
• A cada célula se le asigna un perfil genético que describe la abundancia relativa de genes detectados en su interior.
• Muchas células comparten el mismo perfil genético, donde un perfil genético describe idealmente un tipo de célula.
• A veces necesitamos comparar conjuntos de datos unicelulares en tejidos, y vemos que muchas células en tejidos comparten el mismo tipo de célula.
• Por ejemplo, observe los perfiles de genes púrpura y verde que se comparten en ambos tejidos.

• Las nuevas tecnologías significan nuevos métodos y técnicas para aprovechar las nuevas características que las acompañan.
• Los datos de secuencia de ARN de una sola célula requieren diferentes medios de preparación, secuenciación, control de calidad y análisis de bibliotecas.

Por ejemplo, ¿cómo se capturan y secuencian las células?

Por ejemplo, ¿cómo se capturan y secuencian las células?

En el análisis de secuencia de ARN a granel, el proceso implica tomar una muestra, eliminar moléculas no deseadas y secuenciar todo lo demás.

Por ejemplo, ¿cómo se capturan y secuencian las células?

En el análisis de secuencia de ARN a granel, el proceso implica tomar una muestra, eliminar moléculas no deseadas y secuenciar todo lo demás.

• Para el análisis de una sola celda, el proceso es muy similar, excepto que cada muestra es una celda.
• Y, por lo tanto, debe secuenciarse por separado de otras células.
• Una vez aisladas, se agregan códigos de barras únicos a cada celda y luego se secuencian.

Por ejemplo, ¿cómo se capturan y secuencian las células?

En el análisis de secuencia de ARN a granel, el proceso implica tomar una muestra, eliminar moléculas no deseadas y secuenciar todo lo demás.

• Para el análisis de una sola celda, el proceso es muy similar, excepto que cada muestra es una celda.
• Y, por lo tanto, debe secuenciarse por separado de otras células.
• Una vez aisladas, se agregan códigos de barras únicos a cada celda y luego se secuencian.

• El nivel de resolución en una sola celda es a nivel de celda, y cada celda es única.
• Por lo tanto, el concepto de réplicas biológicas no es exactamente el mismo que el de RNA-seq a granel.

El aislamiento celular se puede realizar de diferentes formas.

El aislamiento celular se puede realizar de diferentes formas.

Un método es el pipeteado manual, en el que los científicos de laboratorio húmedo succionan células individuales utilizando un tubo largo y delgado.

El aislamiento celular se puede realizar de diferentes formas.

Un método es el pipeteado manual, en el que los científicos de laboratorio húmedo succionan células individuales utilizando un tubo largo y delgado.

Pueden hacer esto cientos de veces para aislar cientos de células, pero es propenso a errores y, a menudo, se aíslan varias células juntas.

El aislamiento celular se puede realizar de diferentes formas.

Un método es el pipeteado manual, en el que los científicos de laboratorio húmedo succionan células individuales utilizando un tubo largo y delgado.

Pueden hacer esto cientos de veces para aislar cientos de células, pero es propenso a errores y, a menudo, se aíslan varias células juntas.

Otro método es la citometría de flujo, que reduce el componente de error humano de esta etapa.

• La citometría de flujo hace flotar las células en un baño líquido poco profundo y las hace fluir a lo largo de un canal estrecho, apenas estrecho para que pase una célula.
• De esta manera, las células se pueden cribar por una variedad de propiedades, como por sus propiedades de dispersión de la luz y por el marcaje celular fluorescente.
• Las células se pueden marcar y aislar de esta manera.

• Las propiedades de dispersión óptica se pueden utilizar para sondear el tamaño y la consistencia de la celda, donde las celdas con un tamaño más pequeño que la longitud de onda del láser producen intensidades más bajas y patrones de dispersión más inconsistentes.
• Hay dos tipos principales de dispersión óptica: dispersión hacia adelante y dispersión lateral.

• La dispersión hacia adelante se alinea con el láser principal y mide el diámetro de la celda, lo que es ideal para distinguir diferentes celdas por sus perfiles de tamaño.
• Por ejemplo, monocitos, que normalmente son más grandes que los linfocitos, como se ve en el eje X de la imagen de ejemplo.

• La dispersión hacia adelante se alinea con el láser principal y mide el diámetro de la celda, lo que es ideal para distinguir diferentes celdas por sus perfiles de tamaño.
• Por ejemplo, monocitos, que normalmente son más grandes que los linfocitos, como se ve en el eje X de la imagen de ejemplo.

La dispersión lateral es perpendicular al láser principal y mide la granularidad de la célula, ideal para distinguir células con estructuras internas menos definidas, como los granulocitos en el eje Y de la imagen de ejemplo.

• Las células también pueden seleccionarse y caracterizarse por sus marcadores de superficie celular a través de FACS.
• Al trazar diferentes intensidades de marcadores de superficie entre sí, las células se pueden separar, bloquear y etiquetar en función de estas propiedades fluorescentes.

• Una vez aisladas, las células pueden tener un código de barras.
• Los códigos de barras son secuencias únicas que se agregan a cada molécula de ARN.
• No son exclusivos de la molécula, sino exclusivos de la célula, de modo que dos moléculas de ARN serán etiquetadas con el mismo código de barras de la célula, en caso de que existan en la misma célula.
• Las moléculas de ARN de diferentes células tendrán diferentes códigos de barras de células.

Una vez que las moléculas de ARN han sido etiquetadas por códigos de barras de células, pueden amplificarse, ya sea por separado o agrupadas, donde los productos amplificados comparten los mismos códigos de barras de células que sus contrapartes originales.

• La PCR amplifica los productos génicos para hacerlos más fácilmente detectables durante la secuenciación.
• Cuando hay mucho producto génico para amplificar, como es el caso de la secuencia de ARN a granel, la PCR funciona bastante bien para amplificar todos los productos de una manera razonablemente bien representada.
• Sin embargo, en el caso de productos unicelulares, la cantidad a amplificar es muy pequeña y muchas lecturas únicas pueden perderse durante esta fase, mientras que otras pueden estar sobreamplificadas, como se muestra en las transcripciones azul y roja del ejemplo.

• Para protegernos contra este tipo de sesgo de amplificación, podemos agregar un elemento aleatorio al código de barras.
• Estos códigos de barras aleatorios, conocidos como UMI, etiquetan únicamente transcripciones de modo que es probable que dos transcripciones del mismo gen tengan diferentes códigos de barras aleatorios.

• Consideremos el ejemplo de la izquierda: tenemos 2 transcripciones rojas y 2 transcripciones azules dentro de la celda, que después de la amplificación equivalen a 6 transcripciones rojas y 3 transcripciones azules.
• Si comparáramos la expresión génica diferencial entre las transcripciones rojas y azules, con solo mirar las lecturas amplificadas, llegaríamos a la falsa conclusión de que las transcripciones rojas se expresan dos veces más que las azules.

• Consideremos el ejemplo de la izquierda: tenemos 2 transcripciones rojas y 2 transcripciones azules dentro de la celda, que después de la amplificación equivalen a 6 transcripciones rojas y 3 transcripciones azules.
• Si comparáramos la expresión génica diferencial entre las transcripciones rojas y azules, con solo mirar las lecturas amplificadas, llegaríamos a la falsa conclusión de que las transcripciones rojas se expresan dos veces más que las azules.

Sin embargo, si agrupamos las lecturas por sus UMI, y luego contamos solo el número de UMI únicas por transcripción, eliminando la duplicación de las lecturas que comparten la misma transcripción y UMI, llegamos a 2 lecturas rojas y 2 lecturas azules que representan mejor el verdadero número de transcripciones.

• Los UMI son relativamente aleatorios, pero no verdaderamente aleatorios.
• Observe que la UMI rosa aparece dos veces: una en la transcripción azul y otra en la transcripción roja.

• Los UMI son relativamente aleatorios, pero no verdaderamente aleatorios.
• Observe que la UMI rosa aparece dos veces: una en la transcripción azul y otra en la transcripción roja.

Esto se debe a que a menudo hay más transcripciones que UMI disponibles, que dependen de la cantidad de transcripciones en una celda y de la longitud del código de barras.

• Considere un conjunto de códigos de barras de longitud 5 con una distancia de edición de 1 entre códigos de barras adyacentes y otro conjunto con una distancia de edición de 2.
• El primero no es robusto contra los errores de secuenciación comunes de 1 par de bases, pero el segundo solo permite la mitad del número de códigos de barras.
• Esta compensación entre la cantidad de códigos de barras disponibles y la protección contra errores de secuencia es fundamental en el diseño de códigos de barras de celda y UMI.

En el contexto de la amplificación, las UMI no necesitan ser únicas, solo necesitan ser lo suficientemente aleatorias para deduplicar las transcripciones a fin de dar una estimación más precisa del número de transcripciones dentro de una celda.

Así que recapitulemos lo que hemos aprendido: primero, cada celda tiene códigos de barras de celda agregados a cada molécula de ARN en cada celda.

• Luego agregamos UMI aleatorias a todas las transcripciones, que etiquetan aún más las moléculas.
• Estos se pueden utilizar para deduplicar las transcripciones después de la amplificación.
• Después de la amplificación necesitamos realizar algún control de calidad.

• Una forma de hacerlo es establecer umbrales en los límites de detectabilidad de genes y células.
• Considere un análisis gobernado solo por 3 genes (G1, G2 y G3) y 5 células (A, B, C, D y E).
• La primera fila de la tabla superior define el tamaño de la biblioteca, que es el número total de ARN mensajeros en todos los genes de cada célula.
• Las filas siguientes son los umbrales de detectabilidad de genes, que muestran cuántos genes se detectan en cada célula para genes superiores a las cantidades umbral de 0 a 4.
• Vemos que incluso un umbral de más de 3 transcripciones detectadas en una celda determinada todavía mantiene 3 celdas en el análisis: B, C y E. En la tabla inferior, se representa lo contrario, con el número total de transcripciones en todos células para cada gen.
• Al establecer umbrales de detectabilidad, podemos ver cuántas células describe el gen para ese umbral.
• En ambos casos, podemos ver que si establecemos los umbrales demasiado bajos, corremos el riesgo de mantener genes o células de baja calidad, pero si establecemos los umbrales de detectabilidad demasiado altos, corremos el riesgo de perder demasiados.

• Sin embargo, el filtrado puede ser un lujo, ya que muchos conjuntos de datos de secuencia de ARN de una sola célula tienen normalmente una profundidad de secuenciación baja en comparación con la secuencia de ARN en masa.
• Durante el proceso de normalización, las muestras se comparan entre sí para hacerlas más comparables.
• Esto se realiza normalmente mediante el uso de valores medianos. Por ejemplo, para la normalización DE-Seq, se toma el recuento de la media geométrica de una célula y cada valor de gen en esa célula se divide por él y por el valor mediano de todas las medias geométricas de todas las células.
• Si la expresión génica mediana es alta, este método de normalización funciona bastante bien.

• Sin embargo, el filtrado puede ser un lujo, ya que muchos conjuntos de datos de secuencia de ARN de una sola célula tienen normalmente una profundidad de secuenciación baja en comparación con la secuencia de ARN en masa.
• Durante el proceso de normalización, las muestras se comparan entre sí para hacerlas más comparables.
• Esto se realiza normalmente mediante el uso de valores medianos. Por ejemplo, para la normalización DE-Seq, se toma el recuento de la media geométrica de una célula y cada valor de gen en esa célula se divide por él y por el valor mediano de todas las medias geométricas de todas las células.
• Si la expresión génica mediana es alta, este método de normalización funciona bastante bien.

• Pero si la expresión génica mediana es cero, como suele ocurrir con los datos de una sola célula, entonces tenemos el problema de dividir por cero.
• Existen métodos para sortear estos recuentos de cero.

• Uno de estos métodos es el método SCRAN, que funciona creando grupos de celdas superpuestas, de modo que cualquier celda individual se caracteriza por celdas de tamaños de biblioteca similares.
• El método implica dividir todas las celdas en un grupo par e impar por el tamaño de su biblioteca, y organizarlas en una estructura de anillo donde las celdas vecinas en el anillo tienen tamaños similares.

• Se definen grupos superpuestos de tamaños fijos, lo que da como resultado que cada celda sea definida por múltiples grupos.
• Los grupos en los que se encuentra se pueden construir un modelo lineal para esa celda, y los factores de normalización para todas las celdas se pueden determinar de esta manera.

• Con este método, el problema de la cobertura de secuencia baja se soluciona convirtiendo las celdas con tamaños de biblioteca bajos en componentes útiles de un factor de tamaño que se puede aplicar a celdas similares.
• Estos métodos de normalización novedosos eran comunes hace unos años, pero a medida que las tecnologías de secuenciación han mejorado, el problema de muchos recuentos cero en una matriz se vuelve menos importante y los factores de tamaño de normalización se pueden derivar utilizando métodos de secuencia de ARN a granel una vez más.

• Otros factores que debemos tener en cuenta durante un análisis de ARN de una sola célula son los factores no deseados que pueden confundir el análisis.
• Lo ideal sería que los perfiles genéticos que separan los diferentes tipos de células estén impulsados por la variación biológica.
• Sin embargo, existe una variación confusa tanto de fuentes técnicas como biológicas que no son útiles para el análisis pero contribuyen a la variación.

• La variación biológica de confusión aparece en dos formas: explosión transcripcional y variación del ciclo celular.
• El estallido transcripcional es un fenómeno que ocurre en células en las que la transcripción ocurre en estados discretos de activo e inactivo, donde el intervalo entre estos estados es difícil de modelar.
• En la secuencia de ARN a granel, este fenómeno es imperceptible ya que los efectos se promedian en muchas células. Pero en una sola célula, dos células del mismo tipo pueden exhibir diferentes perfiles genéticos simplemente porque una célula estaba transcribiendo activamente y la otra no.
• Esto no es algo que podamos controlar en el análisis, pero es algo de lo que debemos ser conscientes al comprender por qué los grupos de células pueden ser ruidosos.
• La variación del ciclo celular, por otro lado, es un proceso mucho mejor entendido, donde la cantidad de ARN en una célula es aproximadamente el doble que la de una célula del mismo tipo debido a que una se encuentra en la fase G1 temprana y la otra en la fase G1 temprana. Fase M durante el ciclo celular.
• Hay genes que se sabe que covarían con el ciclo celular, por lo que al hacer una regresión del efecto de estos genes, podemos controlar el ciclo celular.

• La variación técnica confusa aparece en tres formas: sesgo de amplificación, eventos de abandono y variación del tamaño de la biblioteca.
• El sesgo de amplificación puede mitigarse mediante UMI como se demostró anteriormente.
• Los eventos de deserción dan lugar a los ceros predominantes en las matrices de recuento, y su efecto se puede reducir utilizando técnicas de normalización inteligentes como el método de agrupación mostrado anteriormente, así como utilizando mejores métodos de secuenciación.

• La variación del tamaño de la biblioteca surge por una variedad de razones diferentes, pero es la principal fuente de variación dentro de un análisis.
• Al igual que la secuencia de ARN en masa, esto se reduce con buenos métodos de normalización.

• Una vez que hemos eliminado los factores de confusión no deseados del análisis, tenemos el problema de cuantificar las relaciones entre las células.
• Desde el punto de vista del análisis de datos, tratamos a cada célula como una observación y a cada gen como una variable.
• Para genomas grandes, esto significa conjuntos de datos de dimensiones extremadamente altas. Las células existen como puntos en este espacio de alta dimensión extremadamente escasamente poblado, lo que dificulta ver las agrupaciones naturales.
• El espacio de alta dimensión se puede reducir mucho simplemente filtrando los genes que no parecen expresarse diferencialmente en todas las células.
• Sin embargo, para encontrar las relaciones entre estas celdas, necesitamos definir las distancias entre las celdas.

• Una matriz de distancias hace exactamente esto, definiendo la distancia entre dos celdas cualesquiera mediante una sola puntuación.
• Aquí usamos la distancia euclidiana en un conjunto de datos tridimensional de 3 genes (G1, G2 y G3) y 3 células (R, P y V).
• La distancia entre dos células cualesquiera se puede calcular como la suma de los cuadrados de la diferencia en los valores de los genes.
• Observe cómo la matriz de distancias es simétrica a lo largo de la diagonal, lo que confirma que, por ejemplo, la distancia de las celdas R a V es la distancia de V a R como se esperaba.

• Una vez que se genera una matriz de distancia, podemos realizar K vecinos más cercanos sobre la matriz de distancia donde se generan bordes dirigidos entre celdas.
• Para cada fila de la matriz de distancia, se seleccionan K de las celdas con los valores de distancia más pequeños que representan el vecino más cercano que tiene la celda de la fila actual a las celdas de la columna seleccionada.
• Si los bordes se comparten mutuamente entre celdas vecinas, esto se denomina enfoque de vecino más cercano compartido.

• Podemos representar este espacio tridimensional fácilmente como 3 ejes independientes con puntos que denotan las celdas.
• Extrapolar este conjunto de ejemplos de dimensiones relativamente bajas a un conjunto de datos reales de miles de dimensiones que está más allá del alcance de la posibilidad humana.
• La reducción dimensional es un tipo de técnica que toma un conjunto de datos de alta dimensión y produce una representación de baja dimensión, generalmente bidimensional, que intenta preservar las distancias entre los puntos de datos.
• Aquí las diferencias relativas entre celdas se mantienen tanto en las representaciones de alta y baja dimensión.
• Hay muchos tipos diferentes de técnicas de reducción de dimensiones, cada una con sus propias fortalezas y debilidades que dependen del tipo y la dimensionalidad de los datos.

• Una vez que el número de variables del conjunto de datos se ha reducido lo suficiente mediante el filtrado y la reducción dimensional, la agrupación se puede realizar más fácilmente.
• Aquí, en esta proyección 2D, cada círculo es una celda y los colores únicos representan los grupos a los que han sido asignados.
• Las distancias físicas entre los grupos de celdas coloreadas nos dicen qué tan bueno es el agrupamiento para esta proyección.

• Al inspeccionar los principales genes expresados diferencialmente en cada grupo frente a todos los demás grupos, se pueden encontrar pistas sobre el tipo de célula que describe el grupo.
• Los tipos de células a menudo se caracterizan por la expresión de genes marcadores específicos, y la presencia de estos genes son fuertes indicadores del tipo.
• El descubrimiento de genes marcadores se puede utilizar para anotar los grupos.

También podemos derivar aún más las relaciones entre estos grupos calculando árboles de linaje en función de la cantidad de ruido en cada grupo, con la expectativa de que las células madre tengan perfiles de expresión ruidosos que produzcan grupos más amplios, y las células maduras tengan perfiles de expresión muy claros que produzcan grupos más ajustados.

• Los tipos de agrupación que es probable que encuentre en un análisis dependen de los conjuntos de datos de entrada, donde es menos probable que las celdas tomadas de muestras de la etapa tardía se agrupen juntas y es más probable que produzcan grandes lagunas visibles conocidas como agrupaciones duras que están claramente definidas diferentes tipos.
• Es más probable que los conjuntos de datos de etapas anteriores produzcan clústeres más suaves, donde los clústeres vecinos comparten límites suaves a medida que los clústeres se entremezclan ligeramente entre sí.

Es de esperar un agrupamiento suave, ya que aunque el agrupamiento es un método estadístico para dividir datos de manera discreta, la biología celular subyacente de los datos es un proceso continuo, donde las células pasan de un estado bien definido a otro a través de etapas intermedias que se representan en entre dos centros de grupos.

• Debido a la naturaleza continua de estos conjuntos de datos de celda única y la dimensionalidad extremadamente alta de los datos, la partición discreta es a menudo un modelo deficiente para la partición de datos.
• Si, en cambio, asumimos que los grupos de células están relacionados entre sí a través de células de transición que naturalmente se encontrarían entre grupos, entonces las múltiples técnicas de aprendizaje son más adecuadas.
• Estas técnicas derivan un paisaje de expresión que no solo se puede usar para relacionar grupos entre sí, sino que también se puede usar para inferir linaje y jerarquía.
• Para realizar realmente la agrupación en clústeres, hay tres métodos de uso común: K-medias, agrupación jerárquica y comunitaria.

• K-medias y K-medianas siguen el mismo método: el número de grupos se define de antemano y se inicializa en posiciones aleatorias.
• Las posiciones se actualizan luego por la contribución de las celdas más cercanas a él que a otras posiciones.
• Este proceso se produce varias veces hasta que las posiciones ya no cambian significativamente o hasta que se ha logrado un número determinado de iteraciones.
• La asignación final de cada celda se convierte en la asignación de grupo.

• La agrupación jerárquica en clústeres es más flexible y no necesita un parámetro inicial para definir el número de clústeres resultantes.
• Aquí los dos puntos más cercanos en una matriz de distancias se unen en un solo grupo, las distancias se recalculan y los dos puntos más cercanos se vuelven a unir.
• Este proceso se repite hasta que todos los datos se han consumido en uno.
• Al rastrear el proceso hacia atrás, se puede establecer una jerarquía que está representada por un dendrograma.

• El agrupamiento de Louvain es un tipo de agrupamiento comunitario ampliamente utilizado para datos de una sola celda.
• Aquí a cada celda se le asigna un vecindario propio y se cuenta el número de enlaces internos y externos entre vecindarios.
• Para cada iteración, se selecciona una celda aleatoria y se coloca dentro de la vecindad de otra celda, y los enlaces internos y externos se cuentan una vez más.
• Si la nueva configuración ha reducido el número de enlaces externos a favor de más enlaces internos, entonces se mantiene la configuración.

Si, en cambio, la nueva configuración ha aumentado el número de enlaces externos, la configuración se rechaza y se selecciona y prueba otra celda. Al realizar esto varias veces, se construye una estructura comunitaria de células con el grado de especificidad que desee el usuario.

• El análisis de celda única no es trivial, y cada etapa, desde el filtrado hasta la normalización, la reducción de dimensiones y el agrupamiento, puede afectar drásticamente el resultado del análisis.
• Debido a la variabilidad en el análisis, uno no debe entrar en pánico ante la incertidumbre.
• El objetivo es jugar con los datos hasta que comience a reflejar la biología.
• Esto puede requerir muchos intentos para lograrlo, y puede que nunca sea perfecto, pero la idea es probar tantas formas diferentes como sea posible para ver a qué conclusiones sólidas puede llegar.

• En este sentido, los vastos recursos de UseGalaxy pueden aprovecharse probando los diferentes caminos del análisis, y Galaxy Training Network ofrece tutoriales y capacitaciones prácticas para ayudarlo en este sentido.
• Explórelos para desarrollar mejor su comprensión.